На каком свойстве ферментов основан метод электрофореза

Главная →
Энзимология

С лечебной целью ферменты вводят различными путями. Для ЛОР-клиники особый интерес представляет введение ферментов физическими методами. Наиболее часто применяется лекарственный электрофорез в постоянном электрическом поле, а также ингаляции аэрозолей.

Метод электрофореза, в котором сочетается действие фермента и небольших дозировок постоянного тока, имеет ряд преимуществ по сравнению с применением ферментных препаратов парентерально. С помощью электрофореза фермент можно вводить непосредственно в ткань патологического участка с нарушенным кровообращением из-за некрозов, инфильтратов, тромбоза сосудов, а также создать более высокие концентрации фермента в пораженном участке при меньших суммарных его дозах. При их введении методом электрофореза обычно не возникает местных и общих аллергических реакций, которые часто наблюдаются при парентеральном введении ферментов, так как последние, являясь для организма чужеродными белками, обладают антигенными свойствами.

Ниже изложены главным образом биохимические обоснования для применения ферментов методом электрофореза. Имеющиеся в руководствах сведения по электрофорезу часто не учитывают физико-химических свойств ферментов — веществ белковой природы, которые очень чувствительны к влиянию рН среды, температуры, ионов тяжелых металлов и другим воздействиям. Поэтому при лечебном применении ферментов методом электрофореза следует учитывать их устойчивость в растворителе, подвижность и полярность, что важно для правильного выбора полюса, с которого будет вводиться фермент.

Для определения полярности необходимо помнить, что ферменты — амфотерные электролиты: в их молекулах имеются свободные карбоксильные группы (-СООН), обладающие кислыми свойствами, благодаря отщеплению ионовводорода, и аминогруппы (-NH2), способные присоединять ионы водорода, приобретая при этом положительный заряд и придавая молекуле фермента щелочные свойства. Степень ионизации этих групп зависит от рН среды: карбоксильные группы полностью диссоциируют в щелочной среде, а аминные — в кислой. Значение рН среды, при котором белковая молекула имеет одинаковое количество положительно и отрицательно заряженных групп, называется ИЭТ. В ИЭТ белки, будучи электронейтральными, неподвижны в электрическом поле постоянного тока. Белки, как и другие лекарственные вещества, могут быть введены методом электрофореза не в молекулярной форме, а в виде ионов. Поэтому электрофорез должен проводиться в растворах с рН, удаленных от ИЭТ вводимого фермента в более кислую или щелочную зону. При этом белок приобретает положительный либо отрицательный заряд. Так, при добавлении водородных ионов (подкисление) подавляется диссоциация карбоксильных групп, белок приобретает катионные свойства и движется к катоду. Подщелачивание среды ведет к диссоциации —NH+ групп, которые превращаются в недиссоциированную форму (—NH2), что приводит к преобладанию в белковой молекуле отрицательно заряженных групп. В этом случае белок находится в форме аниона и передвигается в электрическом поле к аноду. Таким образом, при варьировании рН среды один и тот же фермент можно вводить как с положительного, так и с отрицательного полюса.

ИЭТ белков-ферментов может находиться в кислой, нейтральной, щелочной и даже сильно щелочной среде. ИЭТ трипсина, альфа-химотрипсина, рибонуклеазы, лизоцима, трасилола (ингибитор протеолитических ферментов белковой природы) лежит в щелочной зоне, следовательно, в среде с рН ниже ИЭТ (в частности, рН 7) эти белки являются катионами и должны вводиться с положительного полюса. В более щелочной зоне, чем ИЭТ, они приобретают отрицательный заряд и полюсом их введения становится катод. Ферменты гиалуронидаза и дезоксирибонуклеаза, у которых ИЭТ находится в кислой среде, при рН 7 заряжаются отрицательно и должны вводиться с катода. При значениях рН среды ниже ИЭТ они будут иметь положительный заряд и поэтому их следует вводить с анода.

Трипсин и альфа-химотрипсин в нейтральной среде (рН 7) обладают свойствами катиона и передвигаются к катоду, причем быстрее мигрирует трипсин, ИЭТ которого по сравнению с альфа-химотрипсином (ИЭТ 8,3-9,1) сдвинута в более щелочную сторону (рН 10,1). При смешивании двух ферментов их электрофоретические свойства не изменяются.

Для ферментного электрофореза важно правильно выбрать растворитель, чтобы рН раствора был отдален от ИЭТ, при этом белковая молекула будет обладать более высокой электрофоретической подвижностью. Например, при введении трипсина с ИЭТ 10,1 в качестве растворителя можно использовать физиологический раствор или еще лучше буферный раствор с рН 4-5. С другой стороны, при выборе растворителя необходимо знать рН стабильности фермента, который часто не соответствует рН-оптимуму действия. Так, точка максимальной устойчивости для трипсина находится при рН 2,3 а для химотрипсина — при рН 3-3,5, а рН-оптимум действия для двух протеиназ лежит при рН 7-8.

При повышении рН среды происходит автолиз этих ферментов, которым особенно выражен при рН свыше 8, при этом белок денатурируется с потерей энзиматической активности.

В предварительных опытах, предшествующих электрофорезу, необходимо также проверить влияние гальванического тока на активность используемого энзима. Кроме того, нужно помнить, что ряд катионов и анионов влияют на биологическую активность ферментов. Например, активность дезоксирибонуклеазы тормозится хлористым натрием, а ионы магния или марганца активируют белковые соединения.

Таким образом, применению электрофореза ферментов должны предшествовать тщательные исследования, включающие установление полярности, выбор растворителя и концентрации фермента.

Важной и нерешенной проблемой электрофореза ферментов является выяснение возможности проникновения белковых молекул с молекулярной массой в тысячи раз большей, чем неорганических ионов, в пораженную ткань через кожу и слизистую оболочку. Лишь при воспалении (повышении сосудистой проницаемости) могут создаваться условия для проникновения ферментов с помощью гальванического тока. Трудную задачу представляет собой количественное определение в тканях вводимых с помощью постоянного тока ферментов, поскольку их концентрация при этом незначительна.

Необходимо учитывать также, что ферменты быстро связываются с белками тканей, которые резко снижают их энзиматическую активность.

Другая новая область энзимофизиотерапии — применение ингибиторов ферментов в отоларингологии. Ингибиторы протеолитических ферментов показаны при тех патологических процессах, в генезе которых лежит активация протеолиза и фибринолиза.

В ЛОР-клинике до настоящего времени практически используется только эпсилон-АКК в качестве препарата, тормозящего процессы фибринолиза, а также как антиаллергическое средство.

Большие перспективы открываются при применении природных ингибиторов, которые в отличие от синтетических обладают более широким спектром действия: они подавляют активность многих протеолитических ферментов, активирующихся при ряде воспалительных и аллергических процессов. В частности, при реакции антиген — антитело освобождаются протеолитические ферменты, которые катализируют образование кининов.

Так как ингибиторы имеют белковоподобную природу, перед введением необходимо выяснить их полярность и электрофоретическую подвижность в различных растворителях. Поскольку выпускаемые препараты содержат примеси других неактивных белковоподобных соединений, которые могут изменять электрофоретические свойства, клиническому применению предшествовали биохимические исследования ингибиторов протеиназ. При растворении ингибиторов в физиологическом растворе (рН 6) пантрипин электрофоретически гетерогенен, он состоит из нескольких фракций, движущихся в сторону как анода, так и катода. Контрикал разделяется при электрофорезе на две катодные фракции; трасилол передвигается к катоду в виде одной фракции. Возникает вопрос, где же находится активная фракция? Предлагается определять специфическую ингибиторную активность во всех фракциях по их способности тормозить активность протеиназ. Опыты показали, что основная часть ингибирующей активности (примерно 90%) содержится в быстрой катодной фракции, в анодной фракции активность ингибитора не обнаружена.

На основании этих опытов можно сделать вывод о том, что ингибитор следует растворять в физиологическом растворе и вводить с положительного полюса.

Ингибиторы можно применять для лечения ряда аллергических и воспалительных заболеваний ЛОР-органов путем назального электрофореза. Учитывая дефицит препаратов ингибиторов, а также необходимость использования больших дозировок при парентеральном введении, в терапии регионарных воспалительных и аллергических процессов более целесообразно и экономически выгодно вводить ингибиторы непосредственно в очаг поражения с помощью постоянного тока (гальванический ток не влияет на активность ингибиторов). Так могут быть созданы более высокие концентрации ингибиторов в пораженных тканях, особенно при повышенной проницаемости слизистых оболочек, наблюдающейся при воспалительных и аллергических реакциях.

Приведенные материалы показывают, что успех ферментной физиотерапии в существенной мере зависит от знания физико-химических свойств используемых энзимов, а также возможности проникновения экзогенных ферментов в очаг поражения, длительности их пребывания и выведения их организма. Здесь еще много неясных вопросов, которые могут быть разрешены клиницистами совместно с физиотерапевтами, биохимиками, фармакологами, физиологами. Необходимо внедрение новых методов количественного определения ферментов в тканях, включая применение флюорохромированных ферментов, флюорохромированных антител, а также радиоактивных индикаторов для прослеживания вхождения ферментов в клетки и определения их активности в пораженных тканях.

Среди физических методов терапии ферментами ЛОР-заболеваний наряду с электрофорезом важное значение имеет введение энзимов и их ингибиторов с помощью ингаляций их аэрозолей. Использование ферментов путем ингаляций аэрозолей основано на том, что они могут непосредственно взаимодействовать со специфическими субстратами очага повреждения и вызывать их расщепление.

Методы электрофореза и ингаляций аэрозолей ферментов нашли применение в терапии заболеваний ЛОР-органов — ларингитов, ринитов, воспалений полости рта и глотки, стенозирующих ларинготрахеитов, бронхитов у детей и т.д.