Какие методы исследования способствовали раскрытию свойств клетки
1. Метод дифференциального центрифугирования. При быстром вращении в ультрацентрифуге органоиды клеток располагаются слоями в соответствии со своей плотностью и массой. Более плотные органеллы осаждаются при более низких скоростях, а менее плотные — при более высоких скоростях. Далее исследователи эти слои отделяют и изучают. Данный метод позволяет наблюдать свойства и структуру каждого органоида или макромолекулы клетки.
2. Рентгеноструктурный анализ позволяет определить атомную структуру вещества. Рентгеновские лучи короче ультрафиолетовых.
3. Авторадиография (радиоавтография) — метод изучения распределения радиоактивных веществ в исследуемом объекте, при котором эти вещества как бы сами себя фотографируют. Например, при изучении фотосинтеза биологи с помощью этого метода могут увидеть след радиоактивного диоксида углерода.
4. Световые микроскопы появились еще в XIX веке, они дают увеличение до 1350 раз. Разрешающая способность 0,25 мкм (2,5*10–7). С их помощью можно увидеть ядро, большинство органоидов, хромосомы и деление клеток.
5. Электронный микроскоп дает увеличение в миллион раз (10–6). Появился он в середине XX века. Разрешающая способность 2 нм (2*10–9).
6. Флуоресцентная микроскопия. В ультрафиолетовом свете (его лучи короче лучей видимого света) клеточные компоненты могут светиться. Также они могут светиться при добавлении специальных красителей. С использованием данного метода можно видеть места, где скапливаются нуклеиновые кислоты, жиры, витамины и др.
Физико-химические методы исследования клеток
1. Метод меченых атомов. Используется для изучения биохимических процессов в живых клетках. Чтобы отследить превращения вещества из его предшественника, один из атомов заменяют соответствующим изотопом (водорода, фосфора, углерода). Радиоактивное излучение позволяет наблюдать за соединением, установить этапы его превращения, их продолжительность, зависимость от внешних условий.
2. Хроматография. Метод основан на разнице скорости движения растворенных веществ через адсорбент. Вещества имеют разную молекулярную массу и поэтому с разной скоростью двигаются через волокна фильтровальной бумаги, порошок целлюлозы, другие пористые вещества. Изучаемые вещества, например, основные пигменты экстракта листьев — ксантофилы, каротин, хлорофиллы а, b.
3. Электрофорез. Разделение смеси веществ в растворе обеспечивает электрический ток (в геле). Это помогает разделить смеси веществ в клетке, выделить качественный и количественный состав веществ.
4. Цитохимические методы. Этими методами исследуют препараты костного мозга, крови, различных органов и новообразований. Они основаны на использовании специфических химических цветных реакций для определения в клетках различных веществ. Под действием специально подобранных реактивов происходит окрашивание тех или иных веществ в цитоплазме, а по степени и характеру окраски судят о количестве или активности исследуемых веществ.
В чем разница между цитохимическими методами и хроматографией?
При цитохимических методах ведут цветные химические реакции с помощью специальных реактивов, и по окрашиванию веществ определяют их свойства. В хроматографии выводы о свойствах веществ делают по тому, с какой скоростью они двигаются через пористые вещества.
Методы разделения клеток и их культивирования
1. Методы культуры клеток и тканей. Клетки и ткани выращивают, исследуют, наблюдая за ростом, размножением вне организма, изучают влияние различных веществ, получают гибриды.
2. Метод рекомбинантных ДНК. Вырезают ДНК из клетки, встраивают ее в ДНК бактерий, вирусов, изучают механизм наследственности, мутагенез.
Все достижения науки о клетке связаны с усовершенствованием приборов и развитием физических и химических методов исследования.
Замечание 1
Цитология использует методы исследования, базирующиеся на достижениях химии, биохимии, молекулярной биологии и направлены на изучение структуры, функций и химизма клеток. Однако основными методами остаются микроскопические и, особенно, электромикроскопические, которые дают возможность выявить детали строения клеток на различных уровнях (от клеточного до макромолекулярного).
Световая микроскопия
Мелкие биологические объекты (клетки, ткани) изучаются путём микроскопирования на протяжении более чем 300 лет. С момента использования первых микроскопов в исследовательских целях они постоянно усовершенствовались.
Метод световой микроскопии базируется на том, что сквозь прозрачный объект проходят лучи света, попадающие потом на систему линз объектива и окуляра микроскопа. Главное – это разделительная способность микроскопа, то есть способность давать отдельное изображение двух близко расположенных объектов. Разделительная способность ограничивается длиной волны света: чем меньше длина волны видимого света, тем больше его разделительная способность. Потому разделительная способность светового микроскопа ограничена длиной волны фиолетовой части видимого света – 200 нм. Увеличение в световом микроскопе может достигать 2500 раз.
Готовые работы на аналогичную тему
Получить выполненную работу или консультацию специалиста по вашему учебному проекту
Узнать стоимость
Электронная микроскопия
Электронный микроскоп, сконструированный в 1931 г. Эметом Руска, позволил сделать шаг вперёд в технике микроскопирования.
В случае электронной микроскопии роль светового луча выполняет пучок электронов, который фокусируется не линзами, а магнитами.
- В трансмиссионном электронном микроскопе электроны проходят сквозь объект исследования как лучи света в световом микроскопе. Но при этом должен поддерживаться высокий вакуум. После этого пучок электронов создаёт изображение объекта на фотоплёнке.
- В сканирующем электронном микроскопе электроны отбиваются от поверхности объекта и во время движения создают изображение получают благодаря тому, изображение в обратном направлении. Сканирующий микроскоп даёт возможность проводить прижизненные исследования некоторых объектов.
В любом микроскопе изображение получают благодаря тому, что одни части исследуемого объекта поглощают или отбивают больше света или электронов, чем другие. В световой микроскопии используют красители, для трансмиссионного микроскопа вместо красителей используют напыление платиной или золотом, которые способны отбивать электроны. Для сканирующего микроскопа материал часто замораживают, чтобы получить поверхность, покрытую льдом.
Метод центрифугирования
Этим методом пользуются для изучения отдельных клеточных структур. Клетки предварительно измельчают, центрифугируют и изучают отдельные образовавшиеся фракции.
Метод меченых атомов
Метод меченых атомов предназначен для изучения места совершения тех или иных биохимических процессов в клетке. Замещение радиоактивным изотопом одного из атомов определённого клеточного элемента даёт возможность понаблюдать с помощью приборов за миграцией, локализацией и превращением этих веществ в клетке.
Метод культуры клеток и тканей
Материалом для описанных выше методик цитологических исследований в основном являются клетки, которые предварительно умерщвляют. Однако, значительную заинтересованность вызывает возможность экспериментирования над живыми клетками. Потому разработаны методики изучения определённых сторон жизнедеятельности клеток, инкубированных в специальных питательных средах
Замечание 2
Методом культуры клеток и тканей выращивают из одной клетки, помещённой в питательную среду, многоклеточные организмы или ткани.
Ценность метода культуры тканей состоит в том, что, с одной стороны, объектом исследования является клетка как природная модель – единица биологической активности, приближающая условия эксперимента к нативным. С другой стороны, с ческой активности (клетка, ткань) а биологической активности (клетка, ткань) вылучается из-под влияния коррелятивных связей и зависимостей материнского организма.
Создаются условия in vitro, которые поддаются управлению и регуляции. Такой метод не обеспечивает полных условий жизни ткани (отсутствуют регуляторные влияния организма), однако он даёт возможность исследовать под микроскопом движение, рост и деление клеток, изучать влияние на клетки различных физических и химических факторов.
Комплексные методы исследования клеток
Основные методы исследования клеток показывают богатство арсенала методов в цитологии и дают возможность осуществлять точный анализ, начиная со структуры клетки до молекулярной композиции отдельных её частей. Однако названым методикам свойственны определённые недостатки. Так, выращивание клеток на искусственной среде лишает их регуляторного влияния организма.
Другие методы исследования, в которых фиксация и окрашивание клеток изменяют определённым образом их прижизненную структуру, дают те или иные отклонения. Потому, продолжая исследовать биологию клетки, изучая её строение, химизм, функции, развитие, дифференциацию и старение, учёные часто используют комплексное исследование тех или иных явлений в жизнедеятельности клеток, изучение определённого вопроса с разных сторон. Таким образом, сводятся к минимуму недостатки отдельных методик исследования.
Использование оптических приборов совместно с компьютером обеспечивает всестороннее исследование клетки, её химического состава, цитофизиологии, даёт возможность моделировать физиологические и биохимические процессы в клетках. Иногда исследования проводятся параллельно в различных лабораториях разными методами для того, чтобы получить данные, которые дополняли бы друг друга и в результате создавали представление о процессах в живых клетках.
Замечание 3
Особенную заинтересованность вызывает генная инженерия – изучение генотипа растительного, животного и человеческого организмов, а также возможностей вмешательства в него с целью исправления генетической патологии.
Классический световой микроскоп обладает низкой разрешающей способностью, что не позволяет изучать детали строения клетки размером менее 0,25 мкм. Второй этап изучения клетки относится к тому времени, когда микроскописты трудились над усовершенствованием своих приборов. В это же время – конец 18 в. – французский ученый Антуан де Лавуазье и англичанин Джозеф Пристли создают новую науку — химию. В отличие от морфологии, которая развивается от сложного к простому, химия продвигается от простого к сложному. Начиналась химия с идентификации элементов, атомов и затем продвигалась по пути изучения некоторых их наиболее простых комбинаций — молекул.
Пересечь границу между неорганической и органической химией и позволить проникнуть в живой мир химии помог, впервые проведенный в 1828 г. Немецким ученым Фридрихом Велером, синтез биологической молекулы мочевины. Это стало началом применения химического подхода к изучению клетки. В последующие сто лет были открыты, очищены, структурно изучены и получены синтетическим путем аминокислоты, сахара, жиры, пурины, пиримидины и др. небольшие молекулы. Ученым удалось составить представление о метаболизме этих веществ в организме и путях образования из них основных биологических молекул: белков, полисахаридов и нуклеиновых кислот. Но опять возникли труднопреодолимые препятствия на пути прогресса: перед сложностями структурной комплексности этих крупных молекул классическая химия оказалась бессильна. В течение длительного времени клетки изучали в основном путем наблюдения за ними. Но по мере развития экспериментального метода в естественных науках к нему начали прибегать и при исследовании живых организмов. Это облегчалось мощными биомедицинскими исследованиями проводимыми во второй половине 19 в. В начале 20 в. американец Росс Гаррисон и француз Алексис Каррель установили, что клетки животных можно культивировать в пробирке наподобие того как это делают с одноклеточными организмами. Тем самым они продемонстрировали способность клеток к независимой жизни и создали метод культивирования, который сейчас является одним из самых актуальных.
Но все эти методы, по сути революционные, по-прежнему, были непрямыми, клетка оставалась закрытым черным ящиком. Сохранялась неизведанной огромная пропасть между наименьшей различимой в световом микроскопе частицей и наиболее крупной молекулой, доступной химическому исследованию. В этом неизведанном пространстве были скрыты важные понятия и концепции, неизвестными оставались функции, описанных клеточных структур, их связь с известными биомолекулами – без всего этого жизнь клетки оставалась неразгаданной.
В свою очередь биохимия также обогатилась целым рядом принципиально новых приборов и методов. Особый интерес представляла хроматография, основанная на очень простом феномене – образовании каемки или ореола вокруг пятна (то, что мы видим, когда пытаемся вывести пятно специальным раствором). В основе этого явления лежат различия в скорости движения разных красок в потоке растекающейся жидкости. В начале 20 века русский физиолог и биохимик Михаил Семенович Цвет первым использовал этот феномен. Пропуская экстракт из листьев через вертикальную трубку, заполненную адсорбирующим порошком, он сумел разделить основные пигменты листьев – зеленый и оранжевый – и получить их в виде отдельных окрашенных полос или колец вдоль трубки. Свой метод он назвал хроматография (греч. khroma – цвет, graphein – записывать). Цвет умер относительно молодым и потенциальные возможности его метода оставались неиспользованными до начала 40-х гг. Сейчас существует множество вариантов хроматографии – применимой ко всем веществам, которые могут быть идентифицированы химически.
Близким к хроматографии является электрофорез в геле, при котором не поток растворителя, а электродвижущая сила способствует передвижению и разделению электрически заряженных компонентов. Эти методы произвели переворот в области химического анализа. Теперь на следовых количествах смеси практически любого состава можно провести анализ.
Вторым методом, радикально изменившем химическое исследование живых клеток, явился метод изотопного мечения. Изотопы – это разновидности одного и того же химического элемента, отличающиеся по атомной массе. Некоторые изотопы существуют в природе, многие могут быть получены искусственным путем в процессе ядерных реакций. Изотопы используются для специфического мечения определенных молекул, такие молекулы можно отличить от им родственных без нарушения общей структуры. Этот метод используется при анализе биосинтетических процессов, которые не могли быть изучены другим способом. Например, с получением меченых аминокислот появилась возможность изучать их соединение в белки в живом организме или в экспериментальных условиях, даже, несмотря на бесконечно малое количество вновь образованного белка, благодаря его радиоактивности. Широкое распространение этот метод получил с созданием атомных реакторов и производством широкого спектра радиоизотопов. Без метода меченых атомов достижения клеточной и молекулярной биологии были бы невозможны.
Таким образом, и морфология, и биохимия, обогащенные новыми методами постоянно совершенствовались, разрыв между их знанием становился все меньше и исчез совсем, когда появилась возможность разделить клетку на части таким образом, чтобы каждую часть можно было бы независимо изучить.
Методы, применяемые для такого фракционирования, основываются главным образом на центрифугировании. Этот метод использует различия в физических свойствах, в частности величине и плотности, тех или иных составных частей клетки для отделения их друг от друга. Это позволило изучить большую часть клетки и объединить морфологическое и биохимическое знание.
Однако одна часть клетки – ее важнейшая центральная часть, ядро – оставалась в значительной степени недоступной, пока не произошло еще одно событие. А началось оно с попытки проанализировать с помощью генетики особенности некоторых простых вирусов, инфицирующих бактерии и названные бактериофагами или пожирателями бактерий. Это исследование оказалось верным подходом к решению проблемы генетической организации, которая даже у простейших неклеточных организмов была необыкновенно сложной. Длительное время новая дисциплина известная сегодня как молекулярная биология, ограничивалась изучением вирусов и бактерий, но затем она буквально ворвалась в эукариотическую клетку, позволив изучать регуляцию жизнедеятельности клетки.
Для изучения молекулярных основ организации клетки необходим детальный биохимический анализ. Для него необходимо значительное количество клеток определенного типа, поэтому невозможно использовать кусочки ткани, ведь они содержат клетки разных типов. На первом этапе работы кусочки ткани превращают в суспензию. Это можно сделать, разрушив межклеточное вещество и межклеточные связи. Для этого ткань обрабатывают протеолитическими ферментами, разрушающими белки (трипсин, коллагеназа). В соединении клеток, их слипании большую роль играет кальций, поэтому используют и вещества хелатирующие, которые связывают кальций. Затем ткани подвергают мягкому механическому разрушению и разделяют на отдельные клетки. Второй этап – разделение суспензии на отдельные фракции. Для этого используют центрифугирование, с помощью которого крупные клетки отделяют от мелких, а легкие – от тяжелых или используют антитела, и способность клеток с разной прочностью прикрепляться к стеклу или пластмассе. Третий этап – введение выделенных клеток в культуру. Первые опыты были проведены в 1907 г. Гаррисоном, он культивировал спинной мозг амфибий в сгустке плазмы. Среды для культивирования имеют довольно сложный состав. Стандартная среда была разработана в начале 70-х, она содержит набор из 13 аминокислот, 8 витаминов, минеральные соли. Кроме того, в среду могут включаться глюкоза, пенициллин, стрептомицин, сыворотка лошади или теленка. Как показали Хайфлик и Мурхед в 1961 г., большинство клеток млекопитающих погибает в культуре после определенного числа делений. Клетки кожи человека делятся в культуре 50-100 раз. Однако в культуре иногда появляются мутантные клетки, которые могут размножаться бесконечно, образуя клеточную линию. В 1952 г. была выделена перевиваемая клеточная линия из раковой опухоли шейки матки, известная как линия HeLa. Такие линии хранят при температуре -70 С, после размораживания они сохраняют способность делиться. Метод культивирования растительных клеток был разработан к 1964 г. Пользуясь им, удалось вырастить in vitro целое растение моркови из клеток корня.