Альфа 1 антитрипсин в каких продуктах содержится

Изобретение относится к области фармации, а именно к новому способу получения альфа-1-антитрипсина и его фармацевтическому продукту. Сущность изобретения состоит в том, что из фракции Кона IV-1 выделяют альфа-1-антитрипсин путем ее солюбилизации, удаляют примесные белки и возможные вирусные частицы полиэтиленгликолем, осаждают целевой белок солью цинка, проводят вирусную инактивацию сольвент/детергентом, фракционируют с использованием Q-сефарозы и удаляют неактивный альфа-1-антитрипсин с использованием S-сефарозы с получением продукта, представляющего собой концентрат активного альфа-1-антитрипсина плазмы крови человека чистотой более 98% с удельной активностью не менее 40 МЕ/мг в 0,15 М растворе хлорида натрия. Техническим результатом является повышение выхода активного альфа-1-антитрипсина с чистотой более 98%. 2 н. и 2 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к области биотехнологии, фармации и медицины и касается нового способа получения альфа-1-антитрипсина, фармацевтический продукт которого можно использовать в медицине.

Альфа-1-антитрипсин (ААТ) представляет собой гликопротеин с молекулярной массой около 55 кДа. Основная функция — ингибитор сериновых протеиназ, таких как трипсин, эластаза, химотрипсин и др. В настоящее время ААТ применяется для хронической заместительной терапии при наследственном дефиците альфа-1-протеазного ингибитора с клиническими признаками панацинарной эмфиземы или при снижении показателя объема форсированного выдоха 1 (ОФВ1) менее 50%, для профилактики хронических заболеваний легких у недоношенных новорожденных, в том числе требующих проведения искусственной вентиляции легких. Невысокая чистота выпускаемых препаратов (так, препарат «Prolastin», Bayer Corp. содержит не только около 40% посторонних белков, но и неактивный ААТ — Lomas DA et al Eur.Respir.J. 1997, 10, 672-675; Lebing WR et al. US Patents 5610285 and 6462180) ограничивает применение ААТ в других областях. Другим ограничительным моментом использования препаратов, содержащих альфа-1-антитрипсин, является их высокая цена, что связано как со стоимостью сырья, так и несовершенством технологий. Одна из основных проблем при создании эффективного способа получения ААТ — стабилизация данного серпина на всех критических технологических этапах. На решение этой задачи и направлено данное изобретение.

Предшествующий уровень техники

Серпины относятся к группе белков, нативная конформация которых находится в метастабильном состоянии. Переход в энергетически более выгодное состояние происходит в процессе выполнения серпинами своей основной функции — ингибирования сериновых протеиназ. Искусственный перевод нативного ААТ из метастабильного состояния в более стабильное приводит к потере белком его функциональной активности. В связи с этим встает проблема стабилизации конформационного состояния нативного ААТ в процессе выделения, очистки и хранения. Это позволит получать не только высокоактивный конечный препарат, но и повысит его выход в процессе очистки.

Широкомасштабные конформационные перестройки, характерные для серпинов, определяются особенностями их пространственной организации и взаимодействием с окружающим растворителем. Так, для препарата ААТ, полученного по технологии рекомбинантной ДНК, предложены его конъюгаты с декстраном, за счет которых повышается стабильность готового продукта при нагревании и изменении рН (Gautam Mitra, US Patent 4496689).

Хорошо известен факт стабилизации структуры белков за счет введения в окружающий их водный раствор дополнительных соединений: сахаров, аминокислот и т.п. (см., например, Timasheff S.N. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 2002, 99, 9721-9726 ). Несмотря на то, что этот факт известен давно, окончательно неясен механизм их влияния. В тоже время, одно и тоже соединение может защищать белок от одних влияний (например, повышения температуры) и никак (или даже отрицательно) сказываться на устойчивости белка к другим воздействиям. Поэтому в каждом конкретном случае приходится решать задачу по-своему. Так, известно, что такой осмолит как триметиламин-К-оксид, защищает ААТ от полимеризации (Delvin GL et al. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2001, 24, 727-732), а сахароза и цитрат защищает лиофилизированный препарат ААТ от тепловой денатурации (Coan VY, Mitra G, Vox Sang 1984, 46, 142-148; Glaser CB et al. Am. Rev. Respir. Div. 1983, 128, 77-81). Однако в отношении цитрата существуют данные, указывающие и на совершенно противоположный эффект — облегчение перехода в латентную форму (Koloczek H et al. Protein. Sci. 1996, 5, 2226-2235; Bottomley SP Biochem. Biophys. Acta 2000, 1481, 11-17). Более того, непонятно, будет ли подобная защита надежной при обработке сольвент/детергентом. Известно, что такой прием, широко используется для вирусной инактивации препаратов плазмы, но при этом заметно инактивирует ААТ (Mast АЕ et al Blood 1999, 94, 3922-3927). Однако, как обеспечить стабилизацию ААТ при такой обработке? Решение этого вопроса позволит не только значительно повысить выход активного ААТ, но и сделать всю технологию более эффективной.

Наиболее близким по последовательности технологических операций к предлагаемому изобретению является способ получения ААТ, изложенный в патенте Lebing WR et al. US Patent 6462180.

В способе-прототипе (Lebing WR et al. US Patent 6462180) метод получения ААТ заключался в том, что после солюбилизации фракции Кона IV-1 в буферном растворе с рН около 9,5 (4,5 часа при температуре 8-20°С и 1-1,5 часа при температуре около 40°С), к суспензии добавляли полиэтиленгликоль 3350 (ПЭГ) до конечной концентрации 11,5%, подведя рН до 5,1-5,35 единиц. После этого использовали специфический сорбент (Hyflo Supercel. RTM) для удаления липопротеинов. После инкубации осадок отбрасывали. К супернатанту добавляли твин 20 и, подведя рН до 7,0, инкубировали 8-10 часов при 20-30°С. После этого, смесь наносили на анионообменник (Q-сефарозу). Связавшийся ААТ элюировали и пропускали через сильный катионообменник, предварительно скорректировав рН до 5,5. В этих условиях целевой белок не связывался с носителем. Полученный раствор подвергали диафильтрации с одновременной ультрафильтрацией. После окончательной стерильной фильтрации препарат лиофильно высушивали. Авторы утверждают, что таким образом можно получить препарат около 95-98% чистоты (по данным иммунонефелометрии) с выходом по целевому продукту 50-75% от стартового материала. Время очистки укладывается в 40 часов. При этом не приводятся данные об активности конечного препарата и ее изменении на этапах выделения. В связи с этим сложно оценить этот ключевой аспект в технологической цепочке, более того, на этапе вирусной инактивации не была введена защита целевого продукта, хотя хорошо известно (Mast АЕ et al Blood 1999, 94, 3922-3927), что ААТ чувствителен к такой обработке.

Специфическую активность альфа-1-антитрипсина определяют по его способности ингибировать эластазу, используя, как правило, хромогенный субстрат N-сукцинил-L-аланил-L-аланил-L-аланил-рМА (см., например, Gautam Mitra US patent 4496689). Эластаза отщепляет pNA от субстрата, что регистрируется по увеличению адсорбции при 405 нм. В присутствие избытка эластазы специфическую активность альфа-1-антитрипсина измеряют спектрофотометрически при 405 нм, используя калибровочный график, построенный с помощью сыворотки, содержащей аттестованное количество альфа-1-антирипсина (например, Protein-Standard-Serum LC-V (Human) Behring, содержащую 5,6 МЕ/мл). Встречается много разночтений при определении удельной активности, поскольку в подавляющем числе работ неопределенным остается метод определения количества белка. Кроме того, при подсчетах, как правило, не учитывается тот факт, что альфа-1-антитрипсин — гликопротеин. Все это приводит к разночтениям в сравнении удельной активности электрофоретически чистых препаратов в пределах 20-25%.

Раскрытие изобретения

В качестве исходного сырья использовали фракцию Кона IV-1, являющуюся побочным продуктом при фракционировании плазмы крови. После ее солюбилизации проводили обработку суспензии полиэтиленгликолем. Полученный осадок отбрасывали, а к супернатанту добавляли соль цинка, например хлорид, сернокислый цинк т.д., и после корректировки рН инкубировали в течение часа. Полученный осадок растворяли в фосфатном буфере, содержащем ЭДТА. После диализа против раствора, содержащего глицин (0,9%) и лизин (0,3%), добавляли тритон Х-100 и три-н-бутил фосфат, корректировали рН до 7,3 единиц и инкубировали 6 часов при комнатной температуре. После этого, подведя величину рН до 6,5, наносили на колонну с Q-сефарозой. После элюции целевого продукта, связанного с носителем, раствор подвергали диафильтрации против 20 мМ фосфатного буфера рН 5,5 и пропускали через колонну с S-сефарозой для удаления неактивного ААТ. В полученной фракции корректировали рН и, добавив ОД5М хлорид натрия, центрифугировали и стерильно фильтровали. Активность препарата контролировали на всех этапах его очистки, используя хромогенный субстрат. Чистота конечного препарата составляла более 98% активного ААТ, выход активного белка — более 50% по отношению к активному ААТ во фракции Кона IV-1, удельная активность составляла не менее 40 МЕ/мг в 0,15М растворе хлорида натрия при 37°С.

Активность ААТ оценивали по его способности ингибировать эластазу в качестве хромогенного субстрата использовали N-сукцинил-(L-аланил)3-паранитроанилид. За ходом реакции следили по изменению оптической плотности при 405 нм. Количественное определение антигена ААТ проводили с использованием пластин Partigen фирмы Data-Behring.

Лучший вариант раскрытия изобретения

К 100 г фракции Кона IV-1 добавили 1500 мл 50 мМ хлорида натрия, рН 6,0 и перемешивали в течение часа при температуре +4°С. После 15 минутного центрифугирования при 4500g супернатант отбрасывали, а к осадку добавляли 1500 мл 10 мМ трис буфера, рН 8,5. После 2-х часовой инкубации при +23°С температуру опускали до +4°С и к раствору добавляли хлорид натрия до концентрации 0,11 М и полиэтиленгликоль до концентрации 11,5%, рН доводили до 5,25 0,5 М уксусной кислотой и инкубировали в течение часа. Осадок отбрасывали после 15 минутного центрифугирования при 4500g. К супернатанту объемом 1810 мл добавляли 8 мл 1М гидроксида натрия для доведения рН до 7,1. Затем добавляли 90 мл 100 мМ хлорида цинка, подводили рН 0,5 М трис до 8,09 и инкубировали в течение часа. После 15 минутного центрифугирования при 4000g, супернатант в объеме 1900 мл отбрасывали, а к 24 г осадка добавляли 200 мл раствора, содержащего 10 мМ ЭДТА, 20 мМ фосфат натрия, рН 7,4. Затем раствор диализовали против 20 мМ фосфата натрия, рН 7,2, проводимость раствора 2.4 мсименс/см. После этого к 230 мл получившегося раствора добавляли глицин до 0,9% концентрации, лизин до 0,3% концентрации, 23 мл 11% тритона Х-100 и 0,72 мл три-н-бутил фосфата, корректировали рН до 7,3 единиц с помощью 0,5 М трис и инкубировали 6 часов при комнатной температуре. Затем доводили рН до 6,5 единиц с помощью 1 М уксусной кислоты и наносили на колонну, содержащую Q-сефарозу (2,6×14 см). Колонна была уравновешена 20 мМ фосфатом натрия рН 6,5, проводимость раствора 2,4 мсименс/см. После промывания колонны проводили элюцию 100 мМ хлоридом натрия в 20 мМ фосфатном буфере, рН 7,0. 260 мл элюата подвергали диафильтрации против 20 мМ фосфатного буфера, рН 5,5, содержащего 5 мМ хлорид натрия, проводимость 2,4 мсименс/см. Полученный раствор наносили на колонну с S-сефарозой (1×15 см), уравновешенную тем же буфером. Проскок собирали, корректировали рН до 7,05 с помощью 0,5 М трис. Доводили концентрацию хлорида натрия до 0,15М, центрифугировали в течение 15 минут при 4500 g и стерильно фильтровали. В результате получали 0,82 г целевого белка чистотой более 98% и выходом активного продукта — 51,4%, активность ингибитора эластазы составила 40 МЕ/мг. Полученный продукт был апирогенным, не проявлял токсичности в экспериментах на лабораторных животных (крысы, кролики), не вызывал аллергических реакций при внутрикожном или внутривенном введении.

Другим аспектом заявленного изобретения является продукт, для использования в медицине, ветеринарии и/или в научно-исследовательских целях, содержащий концентрат активного альфа-1-антитрипсина плазмы крови человека с удельной активностью 40 МЕ/мг в 0,15 М растворе хлорида натрия и чистотой более 98%, полученный способом, приведенным выше.

Продукт может быть представлять собой раствор или лиофилизированный порошок (для чего указанный выше концентрат переносят во флаконы и сушат при замораживании под вакуумом). В случае необходимости он может дополнительно содержать традиционные фармацевтические наполнители, растворители и/или эксципиенты, приемлемые для парентерального (например, внутривенного — струйно или инфузией, внутримышечного, интраназального) введения. Перечисленные вспомогательные вещества смешивают с сухим концентратом или добавляют в раствор согласно общепринятым методам. Наполнителями являются, например, сахара (например, глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза или их смеси), восстановленные сахара (эритрол, маннитол и др.) в физиологически приемлемых концентрациях, в случае необходимости — антиоксиданты, традиционные для инъекционных фармацевтических композиций. Дополнительно продукт может содержать неорганические и/или органические соли и их сочетания для поддержания приемлемых значений рН.

Растворителями для лиофилизированного продукта могут служить дистиллированная апирогенная стерильная вода, физиологический раствор, забуференный физиологический раствор, раствор декстрозы.

Также можно лиофилизировать готовый раствор, содержащий концентрат ААТ и любой из перечисленных вспомогательных веществ, или их сочетания.

В случае необходимости концентрат, содержащий ААТ, можно растворять перед введением в плазме крови, в сыворотке крови больного или смешивать с растворами и/или фракциями белка (белков).

Продукт может иметь соответствующую упаковку и, необязательно, инструкцию по применению.

Предложенный согласно изобретению продукт можно использовать в более широких областях по сравнению с известными ранее. В статистически и методологически обоснованных экспериментальных работах (экспериментальные животные, клеточные линии) было показано, что в отличие от известных аналогов препарат продемонстрировал высокую эффективность при патологиях, характеризующихся как локальной, так и генерализованной активацией протеолитических ферментов: сепсис и системная воспалительная реакция любой этиологии, воспалительные поражения кожных покровов различного генеза, лечении ревматологических заболеваний.

1. Способ получения концентрата альфа-1-антитрипсина, заключающийся в том, что к фракции Кона IV-1 добавляют 50 мМ хлорида натрия рН 6,0, перемешивают в течение часа при 4°С, центрифугируют 15 мин при 4500 g, к осадку добавляют 10 мМ трис буфера, рН 8,5, инкубируют 2 часа при 23°С, охлаждают до 4°С, добавляют хлорид натрия до 0,11 М и полиэтиленгликоль 11,5%, устанавливают рН 5,25 и инкубируют в течение часа, затем центрифугируют 15 мин при 4500 g, к супернатанту добавляют 1М гидроксид натрия до рН 7,1, затем добавляют 100 мМ соли цинка, устанавливают рН 8,09 0,5 М раствором трис буфера и инкубируют в течение часа, затем центрифугируют 15 мин при 4000 g, к осадку добавляют раствор, содержащий 10 мМ ЭДТА, 20 мМ фосфата натрия, диализуют, добавляют глицин 0,9%, лизин 0,3%, тритон Х-100 11%, три-н-бутилфосфат, устанавливают рН 7,3, инкубируют 6 ч при комнатной температуре, устанавливают рН 6,5 и наносят на колонну, содержащую Q-сефарозу, элюируют 100 мМ хлоридом натрия в 20 мМ фосфатном буфере, элюат подвергают диафильтрации против 20 мМ фосфатного буфера, рН 5,5, содержащего 5 мМ хлорида натрия, полученный раствор наносят на колонну с S-сефарозой, устанавливают рН 7,05, концентрацию хлорида натрия 0,15 М, центрифугируют 15 мин при 4500 g и стерильно фильтруют.

2. Продукт, полученный способом по п.1, представляющий собой концентрат активного альфа-1-антитрипсина плазмы крови человека чистотой более 98% с удельной активностью не менее 40 МЕ/мг в 0,15 М растворе хлорида натрия.

3. Продукт по п.2, отличающийся тем, что представлен в виде раствора или в лиофилизированном виде.

4. Продукт по п.2 или 3, отличающийся тем, что дополнительно содержит фармацевтические наполнители, растворители и/или эксципиенты, приемлемые для парентерального, ингаляционного, интраназального и накожного применения.

Источник

[06-078]
Альфа-1-антитрипсин

1055 руб.

Альфа-1-антитрипсин (ААТ) – это белок, производимый печенью и высвобождаемый в кровяное русло. Он принимает участие в инактивации нескольких ферментов, но главная его функция – защита легких от эластазы.

Синонимы русские

ААТ.

Синонимы английские

Alpha1-antitrypsin, A1AT, AAT.

Метод исследования

Иммунотурбидиметрия.

Единицы измерения

Г/л (грамм на литр).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную кровь.

Как правильно подготовиться к исследованию?

  • Не принимать пищу в течение 12 часов до исследования.
  • Исключить физическое и эмоциональное перенапряжение и не курить в течение 30 минут перед исследованием.

Общая информация об исследовании

Альфа-1-антитрипсин – белок, который вырабатывается печенью. Он помогает организму в инактивации ферментов, при этом основная его функция состоит в защите легких от эластазы – она производится нейтрофилами в ответ на повреждения и воспаления. Эластаза расщепляет белки, которые затем перерабатываются организмом и удаляются. Если ее активность не контролируется альфа-1-антитрипсином, она начинает разрушать ткани легких.

Синтез альфа-1-антитрипсина регулируется двумя копиями гена протеазного ингибитора серпина-1. Это так называемый кодоминантный ген, то есть каждая копия гена серпина-1 отвечает за образование половины гена альфа-1-антитрипсина. При изменениях или мутациях одной или обеих копий гена образуется меньшее количество альфа-1-антитрипсина либо его дисфункциональная разновидность. Если в результате этого продукция альфа-1-антитрипсина падает более чем на 30  % ниже нормы, то наступает расстройство, называемое дефицитом альфа-1-антитрипсина. При этом повышается риск возникновения эмфиземы, а также болезней легких в начале полового созревания. Курение и регулярный контакт с дымом и пылью ускоряют развитие болезни и усложняют ее течение из-за повреждения легких.

Дисфункциональный альфа-1-антитрипсин откладывается в клетках печени, производящих его. По мере накопления дефектный альфа-1-антитрипсин образует аномальные белковые цепи, которые начинают разрушать клетки и повреждать печень. Около 10  % больных, подверженных альфа-1-антитрипсиновой недостаточности, страдали от желтухи, будучи еще младенцами. Большинство из них поправляется, однако в тяжелых случаях больным детям для выживания требуется пересадка печени. В настоящее время альфа-1-антитрипсиновая недостаточность является наиболее распространенной болезнью печени в педиатрии.

Количество производимого альфа-1-антитрипсина и его активность зависят от типа унаследованной мутации. Несмотря на то что ген серпин-1 есть более чем в 75 аллелях, лишь несколько из них наиболее распространены. Чаще других встречаются дефектные формы гена S и Z. Существуют различные варианты их наследования.

  • Одна копия М и одна копия S или Z (MS или MZ). В этом случае количество альфа-1-антитрипсина хотя и пониженное, но достаточное для защиты организма. Пациенты с таким сочетанием генов являются носителями болезни и могут передать ее по наследству своим детям.
  • Две копии S (SS) обычно не приводят к клинически выраженному функциональному дефициту антитрипсина либо обуславливают лишь умеренное уменьшение его синтеза (образуют около 60  % необходимого альфа-1-антитрипсина).
  • Одна копия S и одна Z (SZ) повышают риск возникновения эмфиземы (образуется около 40  % альфа-1-антитрипсина от нормального количества).
  • Две копии Z (ZZ) являются причиной наиболее тяжелой формой болезни (образуется лишь около 10  % необходимого альфа-1-антитрипсина). Если такой вариант наследования сочетается с наследованием двух редких копий гена серпина-1, то возникает так называемая нулевая разновидность гена, при которой альфа-1-антитрипсин не образуется совсем.

Для определения уровня альфа-1-антитрипсина, а также для выяснения, какие аллели гена серпина-1 имеются у пациента, применяют следующие методики.

  • Анализ на альфа-1-антитрипсин выявляет уровень этого белка в организме.
  • Определение фенотипа генов, ответственных за синтез альфа-1-антитрипсина, позволяет выявить образующиеся формы белка альфа-1-антитрипсина и сравнить их с известными изоформами.
  • Анализ ДНК-последовательности генов, связанных с образованием альфа-1-антитрипсина, помогает узнать вид мутации гена протеазного ингибитора (серпина-1). Обычно определяются только наиболее распространенные мутации (M, S, Z). Генетический анализ может применяться как для обследования больных пациентов, так и для проверки членов их семей.

Для чего используется исследование?

Для диагностики причин эмфиземы, особенно если пациент не подвержен таким факторам риска, как курение или регулярный контакт с раздражающими веществами типа пыли и дыма.

Для выявления причин продолжительной желтухи и других нарушений функции печени (главным образом у детей и подростков).

Когда назначается исследование?

  • Если желтуха у новорождённого или малолетнего ребенка длится дольше 1-2 недель, при этом у него есть признаки поражения печени (увеличение селезенки, брюшная водянка, зуд).
  • Когда пациент моложе 40 лет жалуется на хрипы, хронический кашель или бронхит, тяжелую одышку после физических нагрузок, а также на другие симптомы эмфиземы. Это особенно важно, когда человек не курит, не контактирует с раздражителями легких и при этом у него диагностировано повреждение нижней части легких.
  • Если у пациента имеется близкий родственник, страдающий от альфа-1-антитрипсиновой недостаточности.

Что означают результаты?

Референсные значения: 0,9 — 2 г/л.

Чем ниже уровень альфа-1-антитрипсина, тем выше риск возникновения эмфиземы.

Опасность последствий образования дефектных форм альфа-1-антитрипсина зависит от общего количества таких форм и от разновидности аномальных генов, кодирующих альфа-1-антитрипсин. Это может быть как эмфизема вследствие недостаточной защиты легких, так и заболевание печени из-за накопления в ней дисфункциональных форм этого белка.

Образование меньшего количества альфа-1-антитрипсина связано с наличием одной или двух аномальных копий гена серпина-1. При этом степень дефицита альфа-1-антитрипсина, а также уровень повреждения легких и/или печени могут сильно варьироваться. У двух пациентов, имеющих одну и ту же дефектную копию гена, болезнь иногда протекает совершенно по-разному.

Изменение уровня альфа-1-антитрипсина происходит при острых и хронических воспалительных заболеваниях, инфекциях, а также при некоторых опухолях.

Концентрация альфа-1-антитрипсина иногда понижается у новорождённых при респираторных заболеваниях, а также при уменьшении количества общего белка из-за, например, поражения почек (нефротического синдрома), недостаточного питания и некоторых видов рака.

Что может влиять на результат?

Показатель анализа может повышаться из-за приема оральных контрацептивов, беременности, стресса и нарушений работы щитовидной железы.



Важные замечания

Дополнительно рекомендуется проведение генетического теста для выявления мутаций в гене серпина-1:

  • если уровень альфа-1-антитрипсина понижен и при этом фенотипический анализ обнаруживает аномальные изоформы этого белка;
  • в тех редких случаях, когда альфа-1-антитрипсин вообще не образуется в организме;
  • при заболевании кого-то из членов семьи либо когда пациент хочет оценить риск возникновения заболевания у своих детей.

Также рекомендуется

  • Ингибитор активатора плазминогена (SERPINE1). Выявление мутации 5G(-675)4G (регуляторная область)

Источник